1 傳統(tǒng)檢測方法的原理和缺點1.1 傳統(tǒng)檢測方法的原理
目前，啤酒腐敗菌的檢測，特別是啤酒生產(chǎn)企業(yè)，大多數(shù)在人工制作培養(yǎng)基上培養(yǎng)。其原理是根據(jù)不同腐敗菌生長所需的營養(yǎng)成分、最適溫度、最適pH，在其適宜的溫度下培養(yǎng)，然后根據(jù)不同菌落、細胞特征及一些生理生化特征的鑒定來確定腐敗菌的類型。理論上只要在啤酒中有一個腐敗菌的細胞，就能在適宜的溫度、培養(yǎng)基上大量生長繁殖。然后通過菌落形態(tài)、細胞形態(tài)、革蘭氏染色、過氧化氫酶陽性以及一系列生理生化實驗來鑒定這些腐敗菌。
1.2 傳統(tǒng)檢測方法的缺點
盡管目前許多企業(yè)仍然在用傳統(tǒng)方法檢測啤酒中的腐敗菌，但傳統(tǒng)檢測方法有以下幾方面的不足。
1.2.1 檢測所需的時間長：一般的腐敗菌檢測至少需要2~5d，甚至7d以上。檢驗結(jié)果出來時往往產(chǎn)品已經(jīng)進入市場，具有嚴重的滯后性。
1.2.2 操作繁瑣，自動化程度不高：傳統(tǒng)的檢測方法往往需要花費大量的人力。適合不同腐敗菌生長的培養(yǎng)基以及不同腐敗菌適宜生長的pH、溫度等都需要花費一定的人力和時間，觀察菌落特征、細胞特征、革蘭氏染色以及生理生化鑒定等步驟較繁瑣。而且，研究表明，沒有一種培養(yǎng)基適合所有的啤酒腐敗菌生長。
1.2.3 檢測結(jié)果不夠準確：啤酒腐敗菌包括一些乳酸菌、醋酸菌和野生酵母等，特別是一部分乳酸菌具有酒花抗性，它們是最重要的啤酒腐敗菌。幾乎所有的乳酸菌都能在啤酒中生長，但只有一部分乳酸菌才能使啤酒腐敗變質(zhì)。所以，用傳統(tǒng)的檢測方法不能真正準確地檢測出啤酒的腐敗菌。
2 PCR技術(shù)檢測啤酒腐敗菌的原理和特點
PCR技術(shù)是由Kleppe等人在1971年首先提出的。它是通過對人工耗時長或難以培養(yǎng)的微生物的DNA或RNA片斷的擴增來對啤酒中腐敗菌進行檢測的。首先通過高溫變性、低溫退火、適溫延伸完成對目的基因的擴增階段，然后將PCR產(chǎn)物通過瓊脂凝膠電泳分析。整個過程可在1h內(nèi)完成。而且從理論上講，只要啤酒中含有一分子的腐敗菌的DNA或RNA片段，即可在短時間內(nèi)通過PCR技術(shù)大量擴增并檢測到。所以，PCR檢測技術(shù)在啤酒腐敗菌的檢測中顯示出其他方法無法比擬的優(yōu)點———快速、便捷、準確。
根據(jù)PCR擴增使用的引物不同。用PCR技術(shù)檢測啤酒中腐敗菌的方法大體可歸為3種類型：使用特異性引物的PCR檢測方法；使用任意引物的PCR檢測方法；使用嵌套式引物的PCR檢測方法。
3 用特異性引物的PCR檢測方法
3.1 根據(jù)抗酒花基因horA設(shè)計特異性引物
盡管啤酒中的許多成分對微生物造成很大的抑制作用，但一些微生物（主要是一些乳酸菌）卻仍然能在啤酒中生長繁殖，并使啤酒產(chǎn)生渾濁、沉淀、異味和雙乙酰等腐敗現(xiàn)象。有趣的是，這些對革蘭氏陽性菌有抑制作用的酒花物質(zhì)（主要是異-α-酸）對這些乳酸菌卻無濟于事。因此，許多學者都致力于抗酒花機理和基因的研究。日本學者從抗酒花菌株短乳桿菌ABBC45的質(zhì)粒上鑒定得到抗酒花基因horA，后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，能引起啤酒腐敗的乳桿菌均含有似horA的基因。1997年，Manabu Sami等還發(fā)現(xiàn)啤酒腐敗菌中這些含有抗酒花基因的質(zhì)粒拷貝數(shù)與酒花抗性大小的增減性是一致的，這說明horA基因與酒花抗性有關(guān)。東京大學、加利福尼亞大學的研究者通過設(shè)計特異性引物對一系列乳桿菌的horA基因擴增進行檢測，已成功地從啤酒中對乳桿菌、干酪乳桿菌、胚芽乳桿菌進行了檢測，且準確性高，整個horA-PCR檢測過程大約需6h，比傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法要快得多。
3.2 根據(jù)其他一些與酒花抗性有關(guān)的基因設(shè)計引物
K.suzuki等對啤酒腐敗菌的研究發(fā)現(xiàn)，在對完全喪失腐敗能力的短乳桿菌ABBC45CC（是經(jīng)過短乳桿菌ABBC45C次級培養(yǎng)獲得的）分析發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒PRH45Ⅱ在短乳桿菌ABBC45CC中丟失，隨后通過對質(zhì)粒PRH45Ⅱ上的不同區(qū)域的片段進行切除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)啤酒腐敗菌缺少ORF5的比例相當高，所以通過對OFRF5的序列設(shè)計引物來進行PCR技術(shù)檢測啤酒腐敗菌也取得了一定效果。最近，Koji Suzuki和T.Fujii通過大量的實驗研究表明，一些含有horA基因的乳桿菌也并不具有腐敗能力，而且他們發(fā)現(xiàn)丟失horA基因的L.brevisABBC45-L.brevisAB-BC45C仍然有一定的腐敗能力。因此，他們認為抗酒花機制是由多重基因控制決定的。Koji Suzuki對51株啤酒腐敗菌研究，還發(fā)現(xiàn)有兩個基因horB和horC與酒花抗性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，通過對horB/horC基因的擴增能檢出其中的49株腐敗菌，且無假陽性的檢出。因此，他們認為PCR技術(shù)檢測通過結(jié)合horA、horB/horC基因能大大提高啤酒中腐敗菌的檢測，同時可避免由horA引起的假陽性現(xiàn)象。
3.3 根據(jù)分類鑒定法設(shè)計特異性引物
啤酒中腐敗菌主要是乳酸菌，其中主要包括短乳桿菌、有害片球菌、林氏乳桿菌等，短乳桿菌、有害片球菌是啤酒中很有名的腐敗菌，而林氏乳桿菌到目前為止發(fā)現(xiàn)的所有菌株都是啤酒腐敗菌。因此，有人用分類鑒定的核糖體RNA上的基因序列來檢測啤酒中的這些腐敗菌。加拿大Labatt公司的研究人員在啤酒腐敗菌的乳酸菌的檢測中使用5S和16SRNA基因進行PCR擴增，用于菌種的特性鑒定。目前已成功地對乳桿菌、片球菌、明膜串珠菌屬中的菌株作出鑒定。日本為了提高PCR分析的靈敏度和特異性，根據(jù)16SrRNA和23SrRNA之間的間隔區(qū)的特異性序列來設(shè)計引物，用于啤酒腐敗菌的PCR檢測。這種方法比較快捷、方便，但有時難以將種內(nèi)一些腐敗菌和非腐敗菌區(qū)分開。
3.4 利用任意引物的PCR檢測方法（RAPD-PCR）RAPD-PCR是使用較短的寡核苷酸引物擴增一群長度不等的DNA片段混合物，這些產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)出的帶型，反映了用于擴增模板的DNA分子的總體結(jié)構(gòu)特征，所以能夠測出2個生物體（包括同一物種的不同個體）基因之間的差異。親緣關(guān)系越近的種，PCR擴增帶型就越相似，反之差異懸殊。
使用RAPD-PCR技術(shù)，所需DNA提取物少，在10h內(nèi)能檢測出啤酒污染的結(jié)果，每一種引物能產(chǎn)生惟一的特異性指紋圖譜，將其對照便得到鑒定結(jié)果，加拿大LABATT公司的研究人員運用此技術(shù)鑒別啤酒腐敗細菌的種和亞種。
3.5 利用嵌套式引物的PCR檢測方法（Nest-PCR）Nest-PCR是利用第一輪PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR擴增的起始原料，除使用第一輪的一對特異性引物外，還加一對結(jié)合位點處在前2個引物之間的新引物。
啤酒中含有大量的酵母，因此用PCR技術(shù)檢測啤酒中腐敗菌時，酵母會對其形成一定的干擾。使用普通的PCR檢測腐敗菌時，酵母細胞的存在如果大于3×104（上角）時，就會干擾細菌的鑒定。如果對樣品進行稀釋來降低酵母的干擾，同樣也會降低檢測水平。而使用Nest-PCR檢測腐敗菌時，由于第一輪反應(yīng)之后增
文章來源華夏酒報加了靶模板數(shù)量，使第二輪反應(yīng)的效率明顯提高；由于第一輪反應(yīng)產(chǎn)物比第一輪反應(yīng)的模板DNA小，所以在第二輪反應(yīng)過程DNA變性時間縮短，也使得反應(yīng)速度加快。
加拿大Labatt公司的研究者通過實驗確定和檢測用于乳酸菌鑒定的Nest-PCR的引物，實驗結(jié)果表明，當酵母和細菌細胞之比為1.6×104（上角）∶1時，凝膠電泳清晰可見。Nest-PCR技術(shù)使在發(fā)酵結(jié)束和酵母回收前24h內(nèi)完成對污染菌的檢測分析成為可能，從而確保了啤酒生產(chǎn)中微生物的控制。
因此，Nest-PCR技術(shù)檢測啤酒腐敗菌能提高檢測效率，特別是對含有高濃度酵母細胞的樣品的檢測。
4 PCR技術(shù)檢測啤酒腐敗菌的發(fā)展趨向
隨著分子生物學、光學、免疫學、微生物學、計算機技術(shù)的快速發(fā)展，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測啤酒腐敗菌也越來越趨向于同其他技術(shù)緊密結(jié)合應(yīng)用。
4.1 取樣
在取樣階段，研究者發(fā)現(xiàn)，啤酒中高濃度物質(zhì)的存在對PCR的靈敏度也有一定的影響。當利用膜過濾啤酒富集乳酸菌用于檢測時，實際靈敏度也隨過濾啤酒體積增加而降低。而不同啤酒的抑制因子也有所不同。日本學者通過在特異性引物的PCR實驗（L.lindner）中發(fā)現(xiàn)使用水樣檢出限（63cfu）比啤酒的檢出限（9cfu）明顯低，這說明啤酒中存在一些抑制因子。
Di Michele和Le Wis進行了大量的實驗發(fā)現(xiàn)，用纖維素酯膜過濾，在丙酮酸中溶解，積累于膜上的PCR抑制因子并沒有除去；采用聚碳酸酯膜，用十六烷基三甲基溴化銨溶液提取，僅適用一些含菌量高的樣品；用聚碳酸酯膜過濾，將膜溶于四氯化碳-異戊醇，再轉(zhuǎn)入Eppendorf管中加水、離心沉淀、取上清液、再加水離心沉淀處理后靈敏度大大提高。日本的學者也用了類似的方法提高了檢測限度。
4.2 引物使用
在使用引物方面，目前盡管研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從L.brevisABBC45的大小為15.1kb的質(zhì)粒pRH45上分離得到的horA基因與細菌的抗酒花作用有很大的關(guān)系。但也有一些實驗表明，丟失含有horA基因的質(zhì)粒pRH45的L.brevisABBC45C 仍然有一定的抗酒花性，這說明抗酒花還可能存在其他基因控制。特別是在對抗酒花菌株質(zhì)粒ORF上的一些核苷酸序列的研究表明（ORF5研究比較深入），其也與抗酒性有很大關(guān)系。因此，PCR技術(shù)檢測啤酒中腐敗菌的設(shè)計引物要從單一的特異性引物向多種特異性引物發(fā)展。不久的將來啤酒腐敗菌的定量檢測也會實現(xiàn)。
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編輯：張怡
