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摘　 要：本研究將從濃香型白酒廠提供的酒醅中分離酵母菌，對其生理生化特性和發(fā)酵特性進行鑒定，以期獲得可以工業(yè)應(yīng)用的酵母菌種。本試驗將酒醅菌液接種至YPD液體培養(yǎng)基中進行增菌培養(yǎng)，然后將增菌培養(yǎng)液接種至含有氯霉素的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。經(jīng)菌落特征、細胞形態(tài)、生理生化特征等方法，篩選出三株酵母菌。對三株酵母菌在30℃條件下進行發(fā)酵實驗，測酵母菌產(chǎn)酒精能力，并通過色譜分析測發(fā)酵液中產(chǎn)酯情況。

關(guān)鍵詞：白酒;酒醅;酵母菌

王友利

(江蘇御珍酒業(yè)有限公司)

白酒是我國特有的傳統(tǒng)蒸餾酒，在漫長的發(fā)展過程中形成了獨特的工藝和風(fēng)味特征。酵母菌在原料淀粉質(zhì)的糖化，酒精的生成，香氣物質(zhì)的形成等方面都起著重要的作用，因此探討酵母微生物區(qū)系的變化，甚至特定發(fā)酵階段的種群結(jié)構(gòu)對白酒生產(chǎn)都有重要的指導(dǎo)意義。

為了比較準(zhǔn)確地把握發(fā)酵過程中酒醅微生物區(qū)系的演變規(guī)律，為濃香型白酒的窖池發(fā)酵機理及物質(zhì)代謝過程的深入探討奠定良好的研究基礎(chǔ)，以便弄清發(fā)酵過程中物質(zhì)變化趨勢與產(chǎn)品質(zhì)量及成分組成之間的相關(guān)關(guān)系，更好地指導(dǎo)濃香型白酒的發(fā)酵生產(chǎn)，江南大學(xué)對醬香型白酒發(fā)酵窖池內(nèi)酵母菌系的結(jié)構(gòu)與功能進行了研究。本課題對濃香型窖池酒醅中微生物的分離培養(yǎng)、酒醅微生物的主要類群分析等方面進行了一些探索，以期為濃香型釀造機理奠定基礎(chǔ)。

酵母菌一般自然分布于高糖偏酸環(huán)境，適宜的生長溫度為25～30℃。酵母菌是兼性厭氧微生物，白酒發(fā)酵的主酵菌群在傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過程中，當(dāng)通氣充分時，酵母菌進行好氧呼吸，代謝能力強、速度快，菌體生長繁殖旺盛，在厭氧發(fā)酵階段的厭氣條件下，進行厭氧呼吸，經(jīng)厭氧乙醇發(fā)酵代謝途徑，發(fā)酵產(chǎn)生乙醇及相關(guān)發(fā)酵產(chǎn)物在白酒發(fā)酵過程中，酵母菌一般在厭氧發(fā)酵的前期，產(chǎn)生乙醇的能力較強，但隨著發(fā)酵過程的進行，酵母菌與環(huán)境生態(tài)因子之間的相互作用，酸性物質(zhì)也逐漸產(chǎn)生和積累，通常導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境的pH下降，進而使酵母菌生理代謝逐漸受到抑制，對發(fā)酵原料的轉(zhuǎn)化利用能力及乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)能力也逐漸下降，甚至停止。

酒醅中酵母菌類以酵母菌屬為主，其次是有一定產(chǎn)香和產(chǎn)酒精能力的漢遜酵母和假絲酵母。酵母菌屬、漢遜酵母都屬原子囊菌亞綱、酵母目，假絲酵母是屬半知菌類的穩(wěn)球酵母科各屬。篩選出酵母菌對酵母菌進行分析，從而得出白酒中酵母菌的種類，從而更加了解酵母菌在發(fā)酵過程中的作用。

1、材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

酵母菌采樣于江蘇御珍酒業(yè)有限公司某車間小組的酒醅。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：

YPD培養(yǎng)基：10g酵母浸膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖，1000mL蒸餾水，121℃，滅菌20min;

酵母菌分離培養(yǎng)基：

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：麥芽膏粉130g，瓊脂15g，氯霉素0.1g，1000mL蒸餾水，121℃，滅菌20min;

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：

硫酸銨2g，硫酸鎂0.2g，磷酸二氫鈉0.5g，氯化鈣0.1g，磷酸氫二鉀0.5g，1000mL蒸餾水;

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：

磷酸二氫鉀1.36g，氯化鈣0.005g，磷酸氫二鈉2.13g，葡萄糖10g，硫酸鎂0.2g，硫酸鐵0.0005g，1000mL蒸餾水。

1.1.3 主要儀器

見表1。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離

將白酒大叉10g放入50mL無菌水中，振蕩、搖勻，制備菌懸液，將菌懸液進行稀釋，按10%的接種量接種至YPD富集培養(yǎng)基中，在搖床中30℃，90rpm，進行12～24h的富集培養(yǎng)，鏡檢培養(yǎng)基中是否有酵母，將富集培養(yǎng)后的酵母進行梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，吸取梯度為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液200μL菌懸液涂布到含有氯霉素的麥芽汁瓊脂平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃，培養(yǎng)48～72h，對酵母菌進行分離。

1.2.2 酵母菌的純化

對分離麥芽汁瓊脂平板上的菌種進行鏡檢，挑去具有酵母菌特征外形的菌落進行檢測，檢測是否為酵母。鏡檢后，挑取經(jīng)鏡檢為酵母菌的平板的單菌落，進行劃線到麥芽汁瓊脂平板，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24h結(jié)合鏡檢，不斷進行劃線分離純化出單一酵母菌株。

1.2.3形態(tài)與培養(yǎng)特征

將酵母菌接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃，90rpm恒溫培養(yǎng)1-2d，觀察是否發(fā)酵、培養(yǎng)液是否渾濁，是否形成環(huán)或島，是否有沉淀及沉淀松緊情況，并制成水鏡片于顯微鏡下觀察，記錄酵母的無性繁殖與細胞的形狀，將酵母菌接種在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)3～4d，觀察其菌落形態(tài)。

1.2.4酵母菌理化指標(biāo)測定

(1)碳源同化實驗

鑒定同化碳源種類有葡萄糖、麥芽糖、α-乳糖、蔗糖、棉籽糖、半乳糖、淀粉纖維二糖。

將上述一定量的碳源，分別加入到氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，滅菌115℃，20min。將經(jīng)活化后的酵母菌分別接種至上述含有不同碳源的培養(yǎng)基中，30℃條件下恒溫培養(yǎng)，觀察其是否生長，且生長良好。結(jié)果觀察標(biāo)準(zhǔn)：將已培養(yǎng)數(shù)天的試管于混合振蕩器上搖動，使內(nèi)容物充分混勻。在一張白色卡片上畫一條約3/4mm 寬的線，將卡片緊靠試管，直對自然光觀察，如果能看到不連續(xù)線段的清晰邊緣，則記為+;如果溶液非常澄清，記為-，表示未有酵母生長，實驗設(shè)置三次重復(fù)，以不加碳源的培養(yǎng)基作為對照。

(2)氮源同化實驗

鑒定同化氮源種類為硝酸鉀、硫酸銨。

該實驗主要觀察分別以硝酸鉀、硫酸銨為唯一氮源時，酵母菌的生長情況。將氮源按照添加比例0.078%(w/w)加入到碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，滅菌115℃，20min，將活化后的酵母分別接種至含有不同氮源的培養(yǎng)基中，30℃條件下恒溫培養(yǎng)一周，結(jié)果觀察標(biāo)準(zhǔn)：將已培養(yǎng)數(shù)天的試管于混合振蕩器上搖動，使內(nèi)容物充分混勻。在一張白色卡片上畫一條約3/4mm 寬的線，將卡片緊靠試管，直對自然光觀察，如果能看到不連續(xù)線段的清晰邊緣，則記為+;如果溶液非常澄清，記為-，表示未有酵母生長，以不加氮源的培養(yǎng)基作為對照，實驗設(shè)置三次重復(fù)。

1.2.5酵母菌發(fā)酵

(1)酵母菌發(fā)酵

按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積的 10%的接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。具體操作如下：

①菌種在YPD斜面上30℃活化兩次，接種于裝有100mL的12°Brix麥芽汁的250mL的錐形瓶中，30℃培養(yǎng)12～18小時;

②發(fā)酵使用500mL三角瓶，內(nèi)裝300mL發(fā)酵培養(yǎng)基，當(dāng)細胞數(shù)目達到對數(shù)生長期時，將二級種子液接種30mL入發(fā)酵培養(yǎng)基中，8層紗布封口，30℃靜置培養(yǎng)，靜置發(fā)酵5d;

③發(fā)酵完成后測定殘醪的酒精度。并對發(fā)酵液進行處理，供后期數(shù)據(jù)的處理與分析。

(2)酒精含量測定

將待測樣品中酒精用蒸餾法餾出，采用重鉻酸鉀-分光光度法于600nm波長處測定。精蒸餾采用干燥100mL容量瓶，準(zhǔn)確量取發(fā)酵液100mL于500ml蒸餾瓶，用50mL蒸餾水分三次沖洗容量瓶.洗液并入蒸餾瓶。連接蛇形冷卻管，用前述取樣用100mL容量瓶做接收器(外加冰浴)，開啟冷卻水緩慢加熱蒸餾，控制蒸餾速度，使蒸餾在30～40min內(nèi)完成。收集餾出液，當(dāng)接近100ml刻度時，取下容量瓶，蓋塞，于20℃水浴中保溫30min，再補加水至刻度，混勻備用。

(3)色譜分析

發(fā)酵液蒸餾：用干燥100mL容量瓶，準(zhǔn)確量取發(fā)酵液100mL于500ml蒸餾瓶，用50mL蒸餾水分三次沖洗容量瓶.洗液并入蒸餾瓶。連接蛇形冷卻管，用前述取樣用100mL容量瓶做接收器(外加冰浴)，開啟冷卻水緩慢加熱蒸餾，控制蒸餾速度，使蒸餾在30～40min內(nèi)完成。收集餾出液，將餾出液進行色譜分析。

色譜柱為CP-WAX57CP，毛細血管柱(長度50m，內(nèi)徑0.25mm，膜厚0.2μm)，柱溫采用程序升溫，初始溫度35℃，保持8min后以4℃/min升至75℃，保持2min，繼續(xù)以15℃/min升溫至180℃，保持2min，再以10℃/min升至210℃，保持13min，以進樣量1μL/min分流進樣，分流比50:1。載氣為氮氣，進氣量25mL/min，檢測器溫度300℃。

2、結(jié)果與討論

白酒的生產(chǎn)以泥窖窖池為基礎(chǔ)，窖池中的多種微生物，特別是棲息于酒醅中的微生物左右著酒的產(chǎn)量和品質(zhì)。酵母菌在原料淀粉質(zhì)的糖化和酒精的生成，香氣物質(zhì)的形成等方面都起著重要的作用，是窖池發(fā)酵三大菌群之一。

在培養(yǎng)基中添加抗生素等抑菌物質(zhì)，可以干擾細菌細胞壁的生物合成，減少菌液中細菌含量，從而提高酵母菌分離選育效率。

本實驗采用YPD富集培養(yǎng)基對酵母菌進行富集培養(yǎng)12-24小時，于此時吸取菌液涂布于含有氯霉素的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，抑制細菌生長，提高酵母分離效率，選取三株單菌落進行劃線，結(jié)合鏡檢純化出單菌落酵母菌，斜面低溫保存。

2.1 酵母菌的分析

2.1.1形態(tài)與培養(yǎng)特征

(1)平板培養(yǎng)特征：見圖1。

上圖為酵母菌接種在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)2d后酵母菌的平板菌落形態(tài)，由上圖知其中A1酵母菌，直徑1～4mm，圓形，乳白色，奶油狀，不透明，表面光滑，粘稠，有發(fā)酵香氣;A2酵母菌，圓形，直徑1～4mm，圓形，乳白色，奶油狀，不透明，表面光滑，粘稠，有發(fā)酵香氣;A3酵母菌，圓形，直徑1～3mm，圓形，乳白色，菌落表面干燥有褶皺，邊緣不整齊，中間凸起，無發(fā)酵香氣。